EN ISO 10993-5
ISO 10993-5 è uno standard pubblicato dall'Organizzazione internazionale per la standardizzazione (ISO) e adottato dal Comitato europeo per la standardizzazione (CEN) dal titolo "Valutazione biologica dei dispositivi medici - Parte 5: Esami per in vitro citotossicità”, i. H "Valutazione biologica dei dispositivi medici - Parte 5: test in vitro-citotossicità".
Stato di regolamentazione e nota di rilascio: il testo di base dello standard è ISO 10993-5:2009 (terza edizione) ed è stato chiamato EN ISO a livello europeo 10993-5:2009 accettato. La modifica A11:2025 è stata aggiunta allo standard e l'attuale versione consolidata EN ISO 10993-5:2009+A11:2025 è in vigore (il 29 gennaio 2025 è stato approvato By CEN, pubblicato nella primavera del 2025)[Riferimento:0] [Riferimento:1]. La modifica A11 aggiorna lo stato dello standard come standard armonizzato aggiungendo annex za nell'ambito dell'MDR (2017/745). L'ambito del riconoscimento della FDA deve essere verificato prima della presentazione della domanda.
Il principio di base della norma è la valutazione del potenziale citotossico di dispositivi medici o materiali componenti in sistemi di coltura cellulare. Questo è considerato il primo e obbligatorio passaggio della serie di test di biocompatibilità; Consente la determinazione dell'effetto tossico a livello cellulare prima di procedere con i test in vivo[Riferimento:3].
L'ambito dello standard include Tre modelli di contatto di base:
1. Metodo di estrazione (metodo di estrazione)
Il materiale di prova viene estratto in determinate condizioni (temperatura, durata, rapporto superficie-volume) in un mezzo di estrazione idoneo (preferibilmente terreno di coltura cellulare contenente siero; in alternativa soluzione fisiologica, DMSO, ecc.). L'estratto ottenuto viene applicato alla coltura cellulare. Le condizioni per la preparazione dell'estratto sono fatte secondo ISO 10993-12[Riferimento:4][Riferimento:5]. Questo metodo è l'approccio più comunemente utilizzato per valutare il potenziale tossico delle sostanze che possono essere rilasciate dal prodotto.
2. Procedure di contatto indiretto (contatto indiretto)
Il materiale di prova viene esposto alla coltura cellulare in modo tale da non entrare in contatto diretto con le cellule (ad esempio per diffusione su uno strato di agar o collagene). Questo metodo viene utilizzato in particolare per valutare il potenziale di componenti a basso peso molecolare di entrare nelle cellule per diffusione.
3. Metodo di contatto diretto (contatto diretto)
Il materiale di prova viene applicato direttamente allo strato cellulare. Questo metodo è adatto per materiali solidi e dispositivi con proprietà superficiali distinte. Consente la valutazione dell'interazione diretta tra la superficie del materiale e le cellule.
Linee cellulari utilizzate
Lo standard consente l'uso di diverse linee cellulari. Le linee cellulari comunemente usate includono [Riferimento:6]:
- L929 (fibroblasti dal tessuto connettivo del topo) - la linea cellulare più comunemente usata[Riferimento:7]
- Balb/3T3 clone A31 (fibroblasti dall'embrione di topo)
- V79 (fibroblasti polmonari del criceto cinese)
- Se necessario, cellule primarie di origine umana (ad es. fibroblasti dermici umani) o altre linee cellulari idonee
Metodi per misurare la vitalità cellulare/citotossicità
Lo standard offre vari metodi quantitativi per valutare la vitalità cellulare:
- Test MTT: Metodo colorimetrico basato sull'attività della deidrogenasi mitocondriale; La formazione di cristalli di formazan nelle cellule viventi viene misurata[Riferimento:8]
- Test RU (assorbimento rosso neutro): una procedura basata sull'assorbimento del colorante rosso neutro nei lisosomi delle cellule viventi
- Test CFU (unità di formazione delle colonie): Valutazione della capacità delle cellule di formare colonie
- XTT, WST-1, LDH e altri metodi quantitativi convalidati
I risultati sono generalmente dati come percentuale di vitalità cellulare e confrontati con il gruppo di controllo. La norma definisce i criteri di accettazione e un sistema di classificazione per la classificazione della citotossicità (ad esempio, una vitalità inferiore al 70% è valutata come citotossica).
I parametri chiave riportati nello studio sono:
- Usato modello di contatto (estratto, indiretto, diretto) e giustificazione
- Condizioni di preparazione estratti (secondo ISO 10993-12: medio, temperatura, durata, rapporto superficie-volume)[Riferimento:9]
- Usato linea cellulare e numero di passaggi
- Densità di semina cellulare e condizioni culturali
- Concentrazioni di estratti (di solito diluizioni del 100%, 50%, 25%, ecc.)
- Durata dell'esposizione (di solito 24 ore)[Riferimento:10]
- Metodo di misurazione meditativo (MTT, NRU, CFU, ecc.)
- Vitabilità cellulare del prodotto (per ciascuna concentrazione) e valore IC50
- Validità dei controlli positivi e negativi
- Classificazione di citotossicità (secondo una scala da 0 a 4 o simili)
- Dati su incertezza di misura e ripetibilità
Perché viene eseguito?
La EN ISO 10993-5 viene eseguita per le seguenti finalità scientifiche e normative:
- Primo esame di biocompatibilità: Determinazione rapida e affidabile del potenziale dei componenti del materiale o degli estratti di un dispositivo medico per produrre effetti tossici a livello cellulare[Riferimento:11]
- Conformità MDR: Fornitura di dati di base sulla valutazione della sicurezza biologica ai sensi del regolamento sui dispositivi medici (2017/745)
- Decisione sulla transizione ai test in vivo: l'uso del risultato della citotossicità per valutare se sono necessari ulteriori test di biocompatibilità (sensibilizzazione, irritazione, impianto, tossicità sistemica, ecc.)
- Materiale e sviluppo: Individuazione precoce di materiali potenzialmente citotossici e valutazione delle alternative all'interno del processo di sviluppo del prodotto
- Controllo del processo di produzione: Valutazione degli effetti delle fasi di produzione come la sterilizzazione, il rivestimento e la purificazione sul profilo di citotossicità
- Protezione animale (3R): Evitare esperimenti animali non necessari attraverso lo screening in vitro; Riduzione delle esigenze di test sugli animali
- Supporto per i documenti di autorizzazione: Utilizzare come componente obbligatorio del fascicolo di biocompatibilità per le domande FDA, secondo l'EU-MDR e altre autorità di licenza
- Approssimativamente a prova: caratterizzazione chimica (ISO 10993-18), genotossicità (ISO 10993-3), sensibilizzazione (ISO 10993-10), irritazione (ISO 10993-23) e altri dati sulla biocompatibilità che contribuiscono alla valutazione olistica del dispositivo medico
La EN ISO 10993-5 di per sé non copre l'intero profilo di biocompatibilità del prodotto; Gli effetti dei tessuti locali, la tossicità sistemica, la genotossicità e l'emocompatibilità vengono valutati utilizzando norme separate. I risultati della citotossicità in vitro potrebbero non riflettere completamente le condizioni in vivo; I risultati dovrebbero essere interpretati in connessione con caratterizzazione chimica, altri test biologici e dati clinici.
Come nanotest, effettuiamo valutazioni di citotossicità in vitro in conformità con la EN ISO 10993-5 nell'ambito della nostra infrastruttura di laboratorio accreditata e del nostro sistema di gestione della qualità con cura scientifica.
Per le vostre valutazioni di citotossicità in vitro secondo EN ISO 10993-5, potete contattare NanoTest per informazioni sulla strategia di prova, il modello di contatto e la selezione della linea cellulare, la preparazione dell'estratto, il metodo di misurazione della vitalità cellulare per ottenere le condizioni per il campionamento, la pianificazione dei test e i processi di reporting.