EP 2.6.14

EP 2.6.14, Pharmacopée européenne (Ph. Eur.), section 2.6 (Essais biologiques) présente la méthode générale relative aux « endotoxines bactériennes ». Cette section décrit les méthodes d'essai utilisant le lysat d'amébocytes de limule (LAL) pour la détermination des lipopolysaccharides (endotoxines) provenant de la paroi cellulaire des bactéries Gram-négatives.

Harmonisation et normes applicables : cette section est harmonisée avec l'USP <85> (essai de détection des endotoxines bactériennes) et la JP 4.01 ; les principes des méthodes, les exigences de validation et les critères d'acceptation sont largement identiques. Parmi les références extérieures à la pharmacopée figurent la norme ISO 10993-11 (Évaluation de la pyrogénicité liée aux matériaux dans les dispositifs médicaux) et la norme USP <161> (Kits de prélèvement sanguin/de contact avec des solvants) ; ces normes sont prises en compte lors de la détection des endotoxines dans les dispositifs médicaux.

Principe fondamental

Le LAL est un lysat issu des amibocytes du crabe à queue en flèche (Limulus polyphemus ou Tachypleus tridentatus) qui, en présence d'endotoxines, déclenche une cascade de coagulation enzymatique. Cette cascade est mesurée, selon la méthode utilisée, sous forme de gélification, de variation de la turbidité ou de coloration. La précision du test est garantie par l'indication de la sensibilité du lysat (λ, UE/mL), l'étalonnage standard des endotoxines (CSE/RSE) et le contrôle d'interférence.

Méthodes

La norme EP 2.6.14 définit quatre groupes de méthodes fondamentaux :

Méthode Gel-Clot : test de seuil et méthode semi-quantitative ; évaluation visuelle de la gélification dans un mélange de lysat et d'endotoxines. Il s'agit de la méthode la plus répandue, considérée comme la méthode de référence.
Méthode turbidimétrique : mesure photométrique de la variation de turbidité résultant de la coagulation ; mode cinétique ou mode à point final
Méthode chromogénique : mesure photométrique du produit coloré résultant de la dégradation d'un substrat synthétique par la cascade de la coagulation ; mode cinétique ou mode à point final
Méthode semi-quantitative du Gel-Clot : variante du test de seuil avec plusieurs dilutions

Calculs et notions importants

Seuil d'endotoxines (EL) : seuil défini dans la monographie (par exemple, formule K/M pour les produits parentéraux ; K = dose seuil pyrogène, M = dose humaine maximale par kg et par heure)
Dilution maximale valide (Maximum Valid Dilution, MVD) : MVD = (EL × concentration de l'échantillon) / λ
λ (lambda) : sensibilité indiquée du lysat (UE/mL)
CSE (Control Standard Endotoxin) : étalon de contrôle des endotoxines étalonné par rapport au RSE (Reference Standard Endotoxin)
PPC (Positive Product Control) : confirmation de la détection d'une quantité connue d'endotoxines dans l'échantillon ; évaluation des interférences (inhibition/potentialisation)
Test d'interférence (Test for Interfering Factors) : doit être réalisé pour chaque produit au cours de la phase de validation ; élimination de l'interférence par une dilution appropriée ou une adaptation de la méthode

Les paramètres fondamentaux présentés dans l'étude sont les suivants :

Description du produit, limite d'endotoxines (EL) et fondement de celle-ci (monographie/formule)
Méthode LAL utilisée (agrégat de gel, turbidimétrique, chromogène) et mode
Lot de lysat, valeur λ et informations du fabricant
Données d'étalonnage et de validation CSE/RSE
MVD et dilutions utilisées
Résultats du test d'interférence (récupération PPC, plage d'acceptabilité)
Résultats des contrôles négatifs et positifs
Résultats d'analyse et comparaison avec l'EL
Édition de la pharmacopée utilisée (Ph. Eur. Edition) et version du chapitre
Incertitude de mesure et données de répétabilité

À quoi cela sert-il ?

La norme EP 2.6.14 est appliquée aux fins scientifiques et réglementaires suivantes :

Sécurité des produits parentéraux : preuve que la contamination par les endotoxines dans les préparations injectables, les solutions pour perfusion, les collyres et autres produits pharmaceutiques se situe dans les limites autorisées
Conformité à la pharmacopée : réalisation du contrôle prescrit par la loi pour les produits pour lesquels un test d'endotoxines est prévu dans les monographies de la Pharmacopée européenne (Ph. Eur.)
Évaluation des dispositifs médicaux : évaluation de la pyrogénicité liée aux matériaux et des endotoxines dans les dispositifs entrant en contact avec le sang ou des solutions (par exemple, kits de perfusion, cathéters, implants) (en liaison avec la norme ISO 10993-11 et l'USP <161>)
Contrôle des matières premières et des procédés : surveillance de la charge en endotoxines de l'eau (eau purifiée, eau pour préparations injectables), des matières premières et des composants d'emballage dans la fabrication pharmaceutique
Stérilisation et validation des procédés : démonstration de l'efficacité des procédés de dépyrogénisation
Contrôle qualité et validation : évaluation des lots de production au regard des endotoxines avant leur mise sur le marché
Surveillance du marché et inspections : preuve de la conformité à la pharmacopée lors des inspections menées par les autorités compétentes
Bien-être animal (3R) : utilisation du test LAL comme alternative au test des pyrogènes sur le lapin (EP 2.6.8)
Approche relative à la force probante : contribution à l'évaluation globale de la sécurité du produit, en association avec les données relatives à la stérilité, à la biocompatibilité et à la pyrogénicité

La norme EP 2.6.14 porte exclusivement sur les endotoxines bactériennes ; la pyrogénicité liée aux matériaux (pyrogènes non endotoxiques) et la contamination microbienne n'entrent pas dans le champ d'application de ce test et doivent être évaluées à l'aide des méthodes appropriées (EP 2.6.8 : test de pyrogénicité sur le lapin, test de stérilité).

Sous le nom de NanoTest, nous réalisons les tests de détection des endotoxines bactériennes conformément à la norme EP 2.6.14, dans le cadre de notre infrastructure de laboratoire accréditée et de notre système de gestion de la qualité, en faisant preuve de rigueur scientifique.

Pour toute information concernant le choix de la méthode, la validation et les essais de rodage, le calcul de la MVD, les conditions de réception des échantillons, le plan d'essai et les procédures de rapport pour vos essais d'endotoxines bactériennes conformément à la norme EP 2.6.14, n'hésitez pas à contacter NanoTest.

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