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EP 2.6.14

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EP 2.6.14

EP 2.6.14, Europäische Pharmakopöe (Ph. Eur.) Abschnitt 2.6 (Biologische Prüfungen) enthält die allgemeine Methode für „Bacterial Endotoxins“, d. h. „Bakterielle Endotoxine“. Der Abschnitt beschreibt Testverfahren mit Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL) zur Bestimmung von Lipopolysacchariden (Endotoxinen), die aus der Zellwand gramnegativer Bakterien stammen.

Harmonisierung und relevante Normen: Der Abschnitt ist harmonisiert mit USP <85> (Bacterial Endotoxins Test) und JP 4.01; die Prinzipien der Methoden, die Validierungsanforderungen und die Akzeptanzkriterien sind weitgehend identisch. Zu den Referenzen außerhalb der Pharmakopöe gehören ISO 10993-11 (Bewertung der materialbedingten Pyrogenität bei Medizinprodukten) und USP <161> (Blut-/Lösungsmittel-Kontakt-Sets); bei der Endotoxinnachweis bei Medizinprodukten werden diese Normen mitberücksichtigt.

Grundprinzip

LAL ist ein aus den Amöbozyten des Pfeilschwanzkrebses (Limulus polyphemus oder Tachypleus tridentatus) gewonnenes Lysat, das bei Vorhandensein von Endotoxinen eine enzymatische Gerinnungskaskade auslöst. Diese Kaskade wird je nach Methode in Form von Gelbildung, Trübungsänderung oder Farbbildung gemessen. Die Genauigkeit des Tests wird durch die angabe der Empfindlichkeit des Lysats (λ, EU/mL), die Standard-Endotoxin-Kalibrierung (CSE/RSE) und die Interferenzkontrolle gewährleistet.

Methoden

EP 2.6.14 definiert vier grundlegende Methodengruppen:

  • Gel-Clot-Methode: Grenzwerttest und semiquantitative Methode; visuelle Beurteilung der Gelbildung in einer Lysat-Endotoxin-Mischung. Dies ist die am weitesten verbreitete und als Referenzmethode geltende Methode.
  • Turbidimetrisches Verfahren: Photometrische Messung der Trübungsänderung infolge der Gerinnung; kinetischer oder Endpunktmodus
  • Chromogene Methode: Photometrische Messung des farbigen Produkts, das durch den Abbau eines synthetischen Substrats durch die Gerinnungskaskade entsteht; kinetischer oder Endpunktmodus
  • Semiquantitative Gel-Clot-Methode: Erweiterte Form des Grenzwerttests mit mehreren Verdünnungen

Wichtige Berechnungen und Begriffe

  • Endotoxin-Grenzwert (EL): In der Monografie definierter Grenzwert (z. B. K/M-Formel für parenterale Produkte; K = pyrogene Schwellenwertdosis, M = maximale menschliche Dosis pro kg und Stunde)
  • Maximale gültige Verdünnung (Maximum Valid Dilution, MVD): MVD = (EL × Probenkonzentration) / λ
  • λ (Lambda): Angegebene Empfindlichkeit des Lysats (EU/mL)
  • CSE (Control Standard Endotoxin): Gegen den RSE (Reference Standard Endotoxin) kalibrierter Kontrollstandard für Endotoxine
  • PPC (Positive Product Control): Bestätigung der Wiederfindung einer bekannten Endotoxinmenge in der Probe; Bewertung von Interferenzen (Hemmung/Potenzierung)
  • Interferenztest (Test for Interfering Factors): Muss für jedes Produkt in der Validierungsphase durchgeführt werden; Beseitigung der Interferenz durch geeignete Verdünnung oder Methodenanpassung

Die in der Studie berichteten grundlegenden Parameter sind folgende:

  • Produktbeschreibung, Endotoxin-Grenzwert (EL) und dessen Grundlage (Monografie/Formel)
  • Verwendete LAL-Methode (Gel-Aggregat, turbidimetrisch, chromogen) und Modus
  • Lysat-Charge, λ-Wert und Herstellerangaben
  • CSE/RSE-Kalibrierung und Validierungsdaten
  • MVD und angewandte Verdünnungen
  • Ergebnisse des Interferenztests (PPC-Wiederfindung, Akzeptanzbereich)
  • Ergebnisse der Negativ- und Positivkontrolle
  • Probenbefund und Vergleich mit EL
  • Verwendete Pharmakopöe-Ausgabe (Ph. Eur. Edition) und Kapitelversion
  • Messunsicherheit und Wiederholbarkeitsdaten

Wozu dient dies?

EP 2.6.14 wird für folgende wissenschaftliche und regulatorische Zwecke angewendet:

  • Sicherheit parenteraler Produkte: Nachweis, dass die Endotoxinkontamination in Injektionspräparaten, Infusionslösungen, Augentropfen und anderen pharmazeutischen Produkten innerhalb der Grenzwerte liegt
  • Pharmakopöe-Konformität: Durchführung der gesetzlich vorgeschriebenen Prüfung für Produkte, für die in den Monografien der Ph. Eur. ein Endotoxintest vorgesehen ist
  • Bewertung von Medizinprodukten: Bewertung der materialbedingten Pyrogenität und Endotoxine bei Produkten, die mit Blut oder Lösungen in Kontakt kommen (z. B. Infusionssets, Katheter, Implantate) (in Verbindung mit ISO 10993-11 und USP <161>)
  • Rohstoff- und Prozesskontrolle: Überwachung der Endotoxinfracht von Wasser (gereinigtes Wasser, Wasser für Injektionszwecke), Rohstoffen und Verpackungskomponenten in der pharmazeutischen Herstellung
  • Sterilisation und Prozessvalidierung: Nachweis der Wirksamkeit von Depyrogenisierungsverfahren
  • Qualitätskontrolle und Freigabe: Bewertung der Produktionschargen hinsichtlich Endotoxinen vor der Markteinführung
  • Marktüberwachung und Inspektion: Nachweis der Pharmakopöe-Konformität bei Inspektionen durch die zuständigen Behörden
  • Tierschutz (3R): Verwendung des LAL-Tests als Alternative zum Pirogen-Test am Kaninchen (EP 2.6.8)
  • Ansatz der Beweiskraft: Beitrag zur ganzheitlichen Sicherheitsbewertung des Produkts in Verbindung mit Daten zur Sterilität, Biokompatibilität und Pirogenität

EP 2.6.14 erfasst ausschließlich bakterielle Endotoxine; materialbedingte Pyrogenität (nicht-endotoxische Pyrogene) und mikrobielle Kontamination fallen nicht in den Geltungsbereich dieses Tests und müssen mit den entsprechenden Methoden (EP 2.6.8 Kaninchen-Pyrogentest, Sterilitätstest) bewertet werden.

Als NanoTest führen wir die bakteriellen Endotoxin-Tests gemäß EP 2.6.14 im Rahmen unserer akkreditierten Laborinfrastruktur und unseres Qualitätsmanagementsystems mit wissenschaftlicher Sorgfalt durch.

Für Informationen zur Methodenauswahl, Validierung und Einlaufprüfung, zur MVD-Berechnung, zu den Probenannahmebedingungen, zum Prüfplan und zu den Berichtsprozessen für Ihre bakteriellen Endotoxintests gemäß EP 2.6.14 können Sie sich gerne an NanoTest wenden.

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