OECD TG 471, OECD-Prüfrichtlinien für die Prüfung von Chemikalien, Abschnitt 4 (Gesundheitseffekte) im Rahmen des „Bacterial Reverse Mutation Test“, d. h. des bakteriellen Rückmutationstests; dieser ist allgemein als Ames-Test bekannt. Er wurde erstmals 1983 verabschiedet und 1997 aktualisiert. Der Test ist ein in-vitro-Genotoxizitätstest zur Bewertung des Potenzials einer Substanz, bei Bakterien eine Rückmutation auszulösen.
Le principe de base du test est le suivant :
- Der Test verwendet auxotrophe bakterielle Mutantenstämme, die eine bestimmte Aminosäure (z. B. Histidin oder Tryptophan) nicht synthetisieren können. Diese Stämme können sich auf einem minimalen Nährmedium ohne Aminosäuren nicht vermehren.
- Die Testsubstanz wird auf diese Stämme aufgebracht. Wenn die Testsubstanz eine Rückmutation verursacht, sind die Bakterien wieder in der Lage, die Aminosäure zu synthetisieren, und vermehren sich durch die Bildung von Kolonien auf dem Minimalmedium.
- Ein Anstieg der Rückmutationsrate ist ein Indikator für das mutagene Potenzial der Testsubstanz.
- Der Test wird sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von metabolischer Aktivierung (S9-Mischung) durchgeführt. Die S9-Fraktion (in der Regel mit Phenobarbital und β-Naphthoflavon induzierte Rattenleber) ahmt den Stoffwechsel von Säugetieren nach und ermöglicht so den Nachweis von Substanzen (Promutagene), die unter in-vivo-Bedingungen zu Metaboliten umgewandelt werden und dadurch mutagen wirken.
Zu den häufig verwendeten Teststämmen gehören:
- Salmonella typhimurium: TA98, TA100, TA1535, TA1537 (oder TA97a/TA97), TA102 – jeder Stamm ist empfindlich gegenüber einem anderen Mutationstyp (Frameshift, Basenpaarwechsel, oxidative Schädigung usw.).
- Escherichia coli: WP2 uvrA (oder WP2 uvrA pKM101) – wird insbesondere für Basenpaarwechsel und oxidative Schäden verwendet.
- Es wird empfohlen, mindestens fünf Stämme (vier S. typhimurium + ein E. coli) zu verwenden; bei Bedarf können weitere Stämme hinzugefügt werden.
Testmethoden:
- Platteninkorporationsmethode (Petri-Schalen-Inkorporation): Die Testsubstanz wird zusammen mit den Bakterien und dem Deckschichtagar in eine Petrischale gegossen. Dies ist ein gängiges und standardisiertes Verfahren.
- Pre-Inkubationsverfahren: Die Testsubstanz und die Bakterien werden in Gegenwart von S9 einer kurzen Vorinkubation (in der Regel 20–30 Minuten) unterzogen und anschließend zusammen mit dem Deckschichtagar in eine Petrischale gegossen. Sie wird insbesondere für flüchtige Stoffe und kurzlebige Metaboliten bevorzugt.
- Bei Bedarf können Exsikkatoren oder gasdurchlässige Systeme für flüchtige Stoffe verwendet werden.
Die in der Studie berichteten grundlegenden Parameter sind folgende:
- Die verwendeten Stämme und ihre genetischen Eigenschaften (Mutationsart, R-Faktor, uvrA/uvrB-Status, rfa-Wandmutation)
- Verwendete Methode (Platteninkorporation oder Vorinkubation)
- Getestete Konzentrationen (in der Regel mindestens 5 Konzentrationen)
- Status der S9-metabolischen Aktivierung (+S9 / −S9) und S9-Konzentration
- Für jeden Stamm und jede Konzentration Anzahl der Rückmutationskolonien (Revertanten/Platte)
- Ergebnisse der negativen (Lösungsmittel-)Kontrolle und der positiven Kontrolle
- Dosis-Wirkungs-Beziehung und statistische Auswertung
- Zytotoxizität der Testsubstanz (Abnahme des Hintergrund-Lawns, Verkleinerung der Kolonien usw.)
- Ergebnis: Bewertung als mutagen / nicht mutagen und Begründung
- Données relatives à l'incertitude de mesure et à la répétabilité
Pourquoi ce test est-il réalisé ?
Die OECD-Testrichtlinie 471 wird zu folgenden wissenschaftlichen und regulatorischen Zwecken durchgeführt:
- Bestimmung des mutagenen Potenzials: Ermittlung des Potenzials der Prüfsubstanz, Rückmutationen in bakterieller DNA zu verursachen
- Bestimmung des genotoxischen Risikos: Früherkennung von Substanzen, die DNA-Schäden verursachen; Bereitstellung eines Screenings im Zusammenhang mit dem Karzinogenitätspotenzial
- Bereitstellung von Vorabdaten für In-vivo-Tests: Schaffung einer Grundlage für die Weiterverfolgung positiver In-vitro-Ergebnisse durch In-vivo-Genotoxizitätstests (z. B. TG 474, TG 475)
- Nachweis von Promutagen: Identifizierung von Substanzen, die im Stoffwechsel von Säugetieren durch das S9-Metabolisierungssystem aktiviert werden
- Unterstützung bei Zulassungsanträgen: Verwendung bei Sicherheitsbewertungen im Rahmen von REACH sowie für Biozide, Pflanzenschutzmittel, Arzneimittel, Kosmetika und Lebensmittelzusatzstoffe
- Kernbestandteil der Genotoxizitäts-Testbatterie: Einbeziehung als Ersttest in behördliche Genotoxizitäts-Teststrategien
- Ansatz der Beweiskraft: Beitrag zur ganzheitlichen Bewertung der Substanz in Verbindung mit anderen Genotoxizitätstests, physikalisch-chemischen Daten und der Expositionsbewertung
- Priorisierung: Screening einer großen Anzahl von Substanzen und Priorisierung für weitere Tests
OECD TG 471, liefert keine eindeutigen Erkenntnisse über Karzinogenität oder Genotoxizität bei Säugetieren an sich. Bakterielle Testsysteme unterscheiden sich von Säugetierzellen (Stoffwechsel, DNA-Reparatur, Chromosomenstruktur). Die Ergebnisse sollten in Verbindung mit anderen In-vitro- und In-vivo-Genotoxizitätstests sowie einer Expositionsbewertung interpretiert werden.
Als Nano-Test führen wir die bakteriellen Rückmutationstests gemäß OECD TG 471 im Rahmen unserer akkreditierten Laborinfrastruktur und unseres Qualitätsmanagementsystems mit wissenschaftlicher Sorgfalt durch. Unser Leistungsumfang umfasst Folgendes:
Versuchsplanung und Erstellung des Protokolls
- Erstellung eines Studienprotokolls gemäß OECD TG 471
- Auswahl der geeigneten Methode (Plate Incorporation oder Präinkubation) entsprechend den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Testsubstanz (Löslichkeit, Flüchtigkeit, Stabilität)
- Auswahl eines geeigneten Lösungsmittels (Vehikel) und Bewertung der Löslichkeit/Stabilität
- Wissenschaftliche Begründung des Konzentrationsbereichs und der Dosierungsstufen
- Auswahl der Stämme und Verifizierung ihrer genetischen Eigenschaften
- Planung einer Negativkontrolle (Lösungsmittel) und geeigneter Positivkontrollen
- Einhaltung ethischer und administrativer Anforderungen (einschließlich mikrobiologischer Sicherheit)
Für Informationen zu Studiendesign, Stamm- und Methodenauswahl, Planung der S9-metabolischen Aktivierung, Probenannahmebedingungen, Testzeitplan und Berichterstattungsprozessen für Ihre bakteriellen Rückmutationstests gemäß OECD TG 471 können Sie sich gerne an Nano-Test wenden.